一聽到高端的光學(xué)顯微鏡，你是不是會立刻想到徠卡、蔡司、奧林巴斯這些國外品牌？現(xiàn)在，我國也具備了高端超分辨光學(xué)顯微鏡的研制能力。

據(jù)“科學(xué)大院”公眾號（kexuedayuan）12月29日消息，中國科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所（簡稱“蘇州醫(yī)工所”）已經(jīng)研制出了激光掃描共聚焦顯微鏡、雙光子顯微鏡、受激發(fā)射損耗(STED)超分辨顯微鏡、雙光子-STED顯微鏡等高端光學(xué)顯微鏡。

12月26日，由蘇州醫(yī)工所承擔(dān)的國家重大科研裝備研制項目“超分辨顯微光學(xué)核心部件及系統(tǒng)研制”通過驗收，標(biāo)志著我國具備了高端超分辨光學(xué)顯微鏡的研制能力。

科研人員正在用自主研制的激光掃描共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)（圖片來源：中科院攝影聯(lián)盟、蘇州醫(yī)工所）

探索微觀世界 離不開高端顯微鏡

高端顯微系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于生物學(xué)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)等相關(guān)前沿領(lǐng)域的創(chuàng)新研究，尤其是10-100nm尺度的超分辨顯微光學(xué)成像技術(shù)，在當(dāng)今生物學(xué)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中，發(fā)揮著不可替代的作用。

作為生物醫(yī)學(xué)實驗研究的必備工具，激光掃描共聚焦顯微鏡比傳統(tǒng)的熒光顯微鏡分辨率更高，而且可以進(jìn)行層析掃描3D成像。但是共聚焦顯微鏡能夠觀察的樣品厚度一般小于100um，要觀察更深的樣品時需要借助雙光子顯微鏡。雙光子顯微鏡最大的優(yōu)勢是觀察的深度。

但是無論是激光掃描共聚焦顯微鏡還是雙光子顯微鏡，都無法擺脫衍射極限的限制，為了進(jìn)一步探索微觀世界，需要分辨率更高的顯微鏡。STED顯微鏡應(yīng)運而生，它在共聚焦顯微鏡的基礎(chǔ)上引入損耗光束將熒光光斑進(jìn)一步壓縮，從而實現(xiàn)超分辨成像。

數(shù)值孔徑為1.45的平場復(fù)消色差顯微物鏡（圖片來源：中科院攝影聯(lián)盟、蘇州醫(yī)工所）

我們都知道，美國和日本都是諾貝爾獎大國，日本從2000年開始基本每年一個諾貝爾獎，其中的原因之一就是離不開顯微鏡等高端儀器的使用。我國雖然是顯微鏡消費大國，但自己只能生產(chǎn)中低端產(chǎn)品，高端儀器基本依賴于進(jìn)口，這已經(jīng)嚴(yán)重制約了我國生物學(xué)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)等相關(guān)前沿領(lǐng)域的創(chuàng)新研究。 

四臺高端顯微鏡 Made in China！

歷時五年攻關(guān)，蘇州醫(yī)工所科研人員全面突破大數(shù)值孔徑物鏡、特種光源、新型納米熒光增強(qiáng)試劑、系統(tǒng)集成與檢測等關(guān)鍵技術(shù)，研制出四臺高端顯微鏡，為我國高端光學(xué)顯微鏡的發(fā)展提供了系統(tǒng)解決方案。

高端平場復(fù)消色差生物顯微物鏡（圖片來源：中科院攝影聯(lián)盟、蘇州醫(yī)工所）

下面我們就來看看這四大國貨神器吧！

1. 激光掃描共聚焦顯微鏡

傳統(tǒng)熒光顯微鏡是用光源照射整個樣品平面，再獲得圖像。由于聚焦平面上下的平面也會受到激發(fā)產(chǎn)生熒光，圖像會被干擾；同時，同一平面上特征點周圍激發(fā)的熒光也會干擾特征點的觀察。

激光掃描共聚焦顯微鏡采用聚焦后的激光光斑作為照明光源，同時在探測器前引入針孔將聚焦光斑外的干擾信號進(jìn)行過濾，因此提高了圖像信噪比，橫向分辨率可達(dá)200nm左右。此外，激光共聚焦顯微鏡還可以對樣品逐層掃描實現(xiàn)三維成像，以及利用多通道采集圖像的功能同時獲取不同光譜段的熒光掃描圖像。

激光掃描共聚焦顯微鏡與普通熒光顯微鏡成像對比（圖片來源：網(wǎng)絡(luò)）

蘇州醫(yī)工所研制的激光掃描共聚焦顯微鏡樣機(jī)（圖片來源：蘇州醫(yī)工所）

激光共聚焦顯微鏡可以觀察細(xì)胞或亞細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)、鑒定細(xì)胞或組織內(nèi)生物大分子，如：檢測蛋白質(zhì)抗體及其他分子，檢測細(xì)胞凋亡，觀察細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)等；還能進(jìn)行活體細(xì)胞或組織功能的實時檢測。

目前，利用蘇州醫(yī)工所研制的高端光學(xué)顯微鏡，中科院動物所觀察發(fā)育生物學(xué)中的基本現(xiàn)象，研究潛在調(diào)控機(jī)制；中科院藥物所觀察藥物胞內(nèi)靶向定位和輸送，加速創(chuàng)新性新藥研發(fā)。

納米藥物在Caco-2細(xì)胞亞細(xì)胞器分布共聚焦成像（圖片來源：中科院上海藥物所）

小鼠卵母細(xì)胞紡錘體共聚焦成像（圖片來源：中科院動物所）

2.雙光子顯微鏡

雙光子顯微鏡結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的特點。

雙光子激發(fā)技術(shù)的基本原理就是用兩個波長較長的光子去激發(fā)一個熒光分子。由于光波波長較長，可實現(xiàn)成像深度超過600微米。那么問題來了，什么情況下可以用兩個光子激發(fā)一個光子，實現(xiàn)能量疊加呢？答案是：提高光子密度。

在進(jìn)行雙光子成像時，物鏡焦點處的光子密度是最高的，雙光子激發(fā)只發(fā)生在物鏡的焦點附近很小的區(qū)域內(nèi)，鄰近區(qū)域不產(chǎn)生熒光，因此不需要針孔過濾信號，提高了信號收集效率。

單光子（共聚焦）激發(fā)與雙光子激發(fā)（圖片來源：網(wǎng)絡(luò)）

蘇州醫(yī)工所研制的雙光子樣機(jī)圖（圖片來源：蘇州醫(yī)工所）

目前雙光子成像在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用于深層組織成像以及活體成像等。美國斯坦福大學(xué)、日本東京大學(xué)、陸軍軍醫(yī)大學(xué)腦科學(xué)研究中心等專業(yè)實驗室利用雙光子顯微成像技術(shù)進(jìn)行了信息識別、行為控制等腦科學(xué)核心問題的研究以及動物在體成像實驗，獲得了高分辨實時神經(jīng)元活動成像數(shù)據(jù)。

CLARITY處理的Thy1-YFP（H Line）小鼠大腦的熒光觀察（圖片來源：網(wǎng)絡(luò)）

（A）從大腦皮質(zhì)到海馬的3-D觀察圖像（B）大腦皮層Ⅴ層的錐體細(xì)胞的樹突圖像

3.受激發(fā)射損耗（STED）顯微鏡

傳統(tǒng)光學(xué)成像由于受到光學(xué)衍射極限的限制，分辨率很難突破200nm。這時就需要超分辨顯微鏡出手了。

光學(xué)衍射極限降低分辨能力（圖片來源：網(wǎng)絡(luò)）

STED顯微鏡是一種超分辨顯微鏡，它的原理可以簡單理解為在共聚焦顯微鏡的基礎(chǔ)上加入一束面包圈狀的光斑（我們稱之為損耗光），通過受激輻射效應(yīng)減小有效熒光發(fā)光面積，將被激發(fā)的熒光物質(zhì)限制在衍射極限內(nèi)，從而突破光學(xué)衍射極限實現(xiàn)超分辨成像，目前能夠?qū)崿F(xiàn)50nm分辨率。

STED原理（圖片來源：網(wǎng)絡(luò)）

細(xì)胞骨架共聚焦與STED對比圖（圖片來源：蘇州醫(yī)工所）

蘇州醫(yī)工所研制的STED樣機(jī)圖（圖片來源：蘇州醫(yī)工所）

STED顯微鏡的應(yīng)用領(lǐng)域與共聚焦顯微鏡相似，主要用于觀察亞細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，活細(xì)胞內(nèi)生物分子的實時成像和動態(tài)跟蹤等。目前，蘇州醫(yī)工所正與中科院上海藥物所以及中科院北京動物所開展相關(guān)合作。

4.雙光子STED顯微鏡

雙光子STED顯微鏡將雙光子顯微鏡與STED顯微鏡合二為一，結(jié)合雙光子顯微鏡成像深度深以及STED顯微鏡分辨率高的優(yōu)點，根據(jù)不同的成像需求選擇合適的成像方式。

蘇州醫(yī)工所研制的雙光子-STED顯微鏡（圖片來源：蘇州醫(yī)工所）

目前，蘇州醫(yī)工所已聯(lián)合吉林大學(xué)第一醫(yī)院、復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院以及蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院針對難治性癲癇、帕金森病及缺血性腦卒中疾病等進(jìn)行研究。

科研人員正在用自主研制的雙光子-STED顯微鏡觀察亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)（圖片來源：中科院攝影聯(lián)盟、蘇州醫(yī)工所）

小鼠腦切片雙光子成像（圖片來源：蘇州醫(yī)工所）

導(dǎo)師，咱們實驗室也買一臺？

在高端顯微鏡的研制過程中，設(shè)計、加工、裝配、檢測等等，并無現(xiàn)成標(biāo)準(zhǔn)、經(jīng)驗可循；關(guān)鍵光學(xué)器件的加工難度超乎想象。

這次通過項目驗收的四套超分辨率顯微鏡，最高分辨率達(dá)到了50納米，而且各有特色?！?strong>在它們的背后，是已經(jīng)發(fā)展起來的顯微光學(xué)設(shè)計、加工、制造、裝配的完整技術(shù)和工程體系。”例如大數(shù)值孔徑顯微物鏡，不過兩個膠囊咖啡大小的物鏡，卻由十幾片直徑為1-30毫米的特種玻璃鏡片裝配而成，做出這樣一個鏡頭，需要解決一系列難題，更需要精密的檢測設(shè)備和嚴(yán)格的檢測標(biāo)準(zhǔn)。

高精度顯微物鏡光學(xué)元件加工（圖片來源：中科院攝影聯(lián)盟、蘇州醫(yī)工所）

目前，蘇州醫(yī)工所研制的顯微鏡和關(guān)鍵部件已有部分成果實現(xiàn)銷售，例如：雙光子顯微鏡已銷往德國、以色列、美國等多家國外研究機(jī)構(gòu)。北京大學(xué)、中科院神經(jīng)科學(xué)研究所等國內(nèi)科研機(jī)構(gòu)也使用了該設(shè)備。具有自主知識產(chǎn)權(quán)的特種LED光源體系具備了國際競爭力，支撐了包括新一代投影、光醫(yī)療儀器以及遠(yuǎn)程照明等新興產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。共聚焦顯微鏡也已完成工程化，擬進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)和銷售。

該項目的成功實施，極大改善了我國高端光學(xué)顯微鏡基本依賴進(jìn)口的狀況，對滿足我國生物醫(yī)學(xué)等前沿基礎(chǔ)研究的定制化需求、提升創(chuàng)新能力，以及推動我國光學(xué)顯微鏡行業(yè)轉(zhuǎn)型升級具有重要的戰(zhàn)略意義。

（作者單位：中國科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所）